污染物質引起的DNA損傷及其檢測
摘要: 排入環境中的污染物質(zhi)能夠對機體遺傳物質(zhi)DNA造成損傷，這些(xie)DNA損(sun)傷包括形成(cheng)DNA加合物、DNA鏈斷(duan)裂及堿基置換等(deng),測定DNA損傷能夠反(fan)映遺(yi)傳毒性物質(zhi)對機(ji)體的影響程(cheng)度(du)。因此(ci)，DNA損(sun)傷(shang)檢測對于評估污染物(wu)質的(de)行為(wei)具有重要(yao)的(de)意義。文章重點介紹了(le)目前(qian)流(liu)行的(de)檢測DNA損傷的方(fang)法，如32P后標記技術、堿性(xing)解旋法(fa)和彗星測定法(fa)等。由于DNA損傷的類型比較多，測定DNA結構損傷(shang)仍(reng)存在相當多的困難，DNA損傷的檢測技術尚須進一(yi)步(bu)完善(shan)，靈(ling)敏度和專一(yi)性需(xu)進一(yi)步(bu)提高。
關鍵詞： 污染物質 ;DNA損傷 ;檢測 ;遺(yi)傳毒性
1 前言
生物標志物（Biomarker），是生(sheng)物(wu)體(ti)暴(bao)露于環境化學(xue)物(wu)質的(de)生(sheng)物(wu)學(xue)效應的(de)變化[1]。這種效(xiao)應可以(yi)發生(sheng)(sheng)在生(sheng)(sheng)化(hua)、細胞、生(sheng)(sheng)理、行為或(huo)能量(liang)的(de)變化(hua)上[2]。生物(wu)(wu)標志(zhi)物(wu)(wu)可(ke)用來(lai)檢測和(he)評估污染物(wu)(wu)質對環境質量的(de)影響并作出預警。在分(fen)子水平上(shang)，通(tong)常把(ba)酶代謝(xie)活性(xing)的(de)增減和(he)DNA結(jie)構的損傷(shang)，作為污染(ran)物(wu)(wu)的生物(wu)(wu)標(biao)志物(wu)(wu)。脫氧核(he)糖(tang)核(he)酸（DNA）存在于生物體的細胞(bao)內，是遺傳(chuan)信息的載體。任何(he)DNA分子的異常(chang)變(bian)化都會導致嚴重的生物學后果[3]，從基(ji)因(yin)(yin)、組織、器(qi)官(guan)、個體、種群(qun)、群(qun)落的不同層(ceng)次表現其效應。因(yin)(yin)此，DNA損(sun)傷作為標(biao)志物的(de)研究，越來越受(shou)到人(ren)們的(de)關注。本文對污染(ran)物質誘導引起的(de)DNA結構(gou)損傷(shang)和機制，及用于(yu)測定DNA損傷的技術與方法進行綜述。
2 DNA結構損傷及其(qi)機制
在細胞(bao)核內(nei)，DNA分子(zi)保(bao)持著一種在穩(wen)態和非穩(wen)態之間的(de)動態平(ping)衡。在正常(chang)條(tiao)件(jian)下，非穩(wen)態只有生(sheng)理過程啟(qi)動時(shi)的(de)暫(zan)時(shi)現象(xiang)（如(ru)DNA復制、分(fen)子在細胞代謝(xie)中的隨機熱碰(peng)撞），在這種情況(kuang)下DNA的(de)損傷很快就被修復(fu)[4]，或變成新的(de)穩定結(jie)構的(de)一部分（如(ru)復(fu)制后修復(fu)），而使機體保持正常運轉。
污染物質進入生物體內后通(tong)常會(hui)擾亂有機體正常細胞(bao)代謝過程，導致DNA結構發(fa)生改變(bian)，從而(er)發(fa)生一(yi)系列細(xi)胞問題(ti)。很(hen)多化學(xue)物質經過體內的酶系統活(huo)化，產生中間代(dai)(dai)謝產物，這類(lei)具有強親電性的代(dai)(dai)謝物可(ke)與脂類(lei)、蛋白、RNA或DNA的親核中心發生(sheng)反應，形(xing)成穩(wen)定或不穩(wen)定的加合物。污染物質與(yu)DNA結合就形(xing)成(cheng)DNA加(jia)合物（DNA Adducts）。很多研究已經證(zheng)明，多種誘變劑或(huo)其活性產(chan)物與(yu)DNA結合(he)形成DNA加合物(wu)，DNA加合物與(yu)基因突(tu)變密切相關，在(zai)人類腫瘤發生中起重要作用[5]。例如，黃曲霉(mei)毒素Ｂ和(he)苯并芘(bi)的強烈(lie)致癌作(zuo)用，就是DNA經生物(wu)活化成為環氧化物(wu)而導致的。污染物(wu)質與DNA共價(jia)結(jie)合，所攻擊的(de)(de)堿(jian)基(ji)和位置有些是專一的(de)(de)，有些則專一程度較低(di)。如AFF僅特(te)異地作(zuo)用(yong)于鳥嘌呤(ling)Ｃ-8位，而烷(wan)化劑則在中(zhong)性環境(jing)中(zhong)幾乎(hu)能與核(he)苷酸鏈上的(de)全部氧和氮原子(除了連接(jie)在戊糖上的氮以外)產生烷化作用。DNA加合(he)物的形成可能是產生DNA突變的第一階段(duan)，以后會發生使DNA鏈斷(duan)裂(lie)、堿基(ji)置換和(he)堿基(ji)缺(que)失(shi)等一(yi)系(xi)列事件。
很多化(hua)合(he)物能夠引(yin)起(qi)DNA鏈直接斷裂。比如由污染(ran)物(wu)質(zhi)經過代(dai)謝(xie)生成的自由基和去堿基位點，能夠引(yin)起DNA分(fen)子內(nei)磷(lin)酸二酯(zhi)鍵的斷裂。污染物質也能干擾DNA的正常活動，如復(fu)制、甲基(ji)化和修復(fu)，這(zhe)些都能夠導(dao)致(zhi)變異（堿基(ji)的增補(bu)或缺失(shi)）。污(wu)染物質引(yin)起(qi)的DNA結構改變及其機制見下表：
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3 DNA損(sun)傷的檢測
由(you)于環境(jing)問題越(yue)來(lai)越(yue)受到關注(zhu)，人們在不斷(duan)發展(zhan)并完善(shan)靈敏的技(ji)術來(lai)檢測化(hua)學物與(yu)DNA的作用，從(cong)而使加合(he)物(wu)的量、甲基化的比例、DNA鏈(lian)斷裂(lie)(DNA Strand Break)的(de)數量等成為DNA損傷的重要指標。
3.1 DNA加合物及其測定
大多(duo)數環境化(hua)(hua)(hua)合物(wu)共價結(jie)(jie)合到在生(sheng)理上起重要作用的受體(ti)分子上，對(dui)生(sheng)物(wu)產生(sheng)負面影響。有(you)機磷(lin)化(hua)(hua)(hua)合物(wu)毒害(hai)作用和化(hua)(hua)(hua)學(xue)致癌的過程，就是(shi)因為(wei)特(te)定化(hua)(hua)(hua)學(xue)物(wu)共價結(jie)(jie)合到分子受體(ti)上才(cai)發生(sheng)的。有(you)些化(hua)(hua)(hua)學(xue)物(wu)與(yu)蛋白質結(jie)(jie)合，有(you)些與(yu)DNA結合，那么只要測定(ding)這(zhe)些產物就能夠鑒定(ding)遺傳毒性物質的毒害作用及其(qi)程度[7]。
目(mu)前，測定DNA加(jia)合物的方(fang)法有多種，但(dan)靈敏性不同，包括熒光光度法、高效(xiao)液相(xiang)色譜法、酶聯(lian)免疫(yi)測(ce)定檢(jian)測(ce)（ELISA）和32P后標記技術(shu)(32P Postlabeling Technique)等。最主要的測定方法是32P后標記技術，此方法在環境監測上得到廣泛的應用[8]。32P后標記技(ji)術測(ce)定DNA加合物的測定包括以下步(bu)驟(zou)：
1）DNA的提取。將組織勻漿分別用蛋白(bai)酶K和RNA酶消化去除蛋白(bai)質(zhi)和RNA，然(ran)后(hou)依次用(yong)飽和酚、氯仿/異戊醇（體(ti)積比(bi)24/1）抽提DNA。
2）DNA酶(mei)解和標記。利用小球(qiu)菌核酸(suan)酶(mei)和脾磷酸(suan)二酯(zhi)酶(mei)進(jin)行酶(mei)解后(hou)，加(jia)入T4多(duo)核苷酸激酶和γ-32P-ATP進行標定。
3）TLC薄層層析。將樣品點在ODS TLC(吸附(fu)薄層(ceng)色譜)板上(shang)，利用DNA加(jia)合(he)物(wu)和DNA正常水解物(wu)色譜(pu)性能(neng)的差異(yi),分(fen)離加合物和正常核(he)酸。不同的(de)DNA加合物采用PEI TLC(陰離子交換薄層(ceng)色譜)板分離分辨。
4）以放射自(zi)顯(xian)影或(huo)液閃(shan)記數(shu)等方法定量(liang)。
此方(fang)法的(de)最大優點是檢(jian)測能力強、應(ying)用(yong)范圍廣，可(ke)檢(jian)測任何(he)化(hua)合物與(yu)DNA的(de)連(lian)接(jie)，尤其是可(ke)用于(yu)環境中生物(wu)樣品的(de)加(jia)合(he)物(wu)測定(ding)及判斷加(jia)合(he)物(wu)的(de)毒(du)性，包括純品或混合(he)物(wu)是否(fou)有(you)潛在的(de)致癌作用。同時具有(you)極高的(de)靈敏度，可(ke)檢(jian)測到(dao)1010個堿(jian)基(ji)中的1個DNA加合(he)物(wu)。該方法在定性(xing)定量(liang)研究遺傳毒性(xing)物(wu)質污(wu)染方面具(ju)有極大的潛力。
3.2 DNA 堿基修飾和其它非加合性結(jie)構損傷及其檢測
污染(ran)物質除了(le)與DNA形成加(jia)合(he)物引起DNA分(fen)子改變外，還可以(yi)間接(jie)引起其它(ta)類(lei)型的損傷。例如(ru)苯(ben)并芘-DNA加合物，能夠干擾DNA甲(jia)基(ji)化(hua)酶的(de)性質(zhi)，阻礙新合成DNA的甲(jia)基化過程，從而(er)使新形成的DNA甲基化(hua)不足。此(ci)外，自由基也能夠引起DNA損傷，這些外源物質經微(wei)粒(li)體代謝(xie)產生的過氧基和氫氧基，通(tong)過DNA堿基的氧化直接損傷DNA，尤其是鳥嘌呤（Guanine）。自由基能(neng)夠使鳥嘌呤產生8-羥脫氫鳥苷（8-OH-dGUO），或(huo)使鳥嘌呤(ling)開環形成2，6二氨基-4羥基-5-甲酰氨基嘧啶（FapyGua）。這2種物質都可以進行定量測(ce)定，以便(bian)評估遺傳毒性物質對(dui)DNA的損傷程(cheng)度(du)[9， 10]。
3.3 DNA鏈斷(duan)裂及其檢測
在(zai)細胞中普遍(bian)存在(zai)著DNA鏈斷(duan)裂(lie)，熱能使細胞內產生成千(qian)上(shang)萬的去(qu)堿(jian)基位(wei)點，在(zai)正常條件下這些位(wei)點迅速被修(xiu)復，但這種破壞(huai)間接導致DNA鏈斷裂（最初(chu)是DNA鏈(lian)堿基的丟失，而這(zhe)種損傷的修復在DNA分子(zi)上產生臨時(shi)的(de)縫隙）。離子(zi)輻射(she)和自由基也能引起DNA鏈斷裂。
DNA的(de)測定基于(yu)以下原(yuan)理(li)：在高(gao)pH下，使DNA變性，從雙鏈DNA釋放的(de)單鏈DNA的(de)量，與DNA鏈斷(duan)裂的(de)數量成一(yi)定比例。應該注意，在DNA分子中去堿基位點(dian)形成(cheng)的單鏈(lian)DNA斷裂，也(ye)能被(bei)檢測出來。
其原(yuan)理是，在一定pH和溫度下，DNA分子內(nei)單股斷裂處發生(sheng)鏈分離，在(zai)一定(ding)的時間(jian)內(nei)，殘余的雙鏈DNA量(liang)與斷裂點的數(shu)量(liang)成反比。這是通(tong)過(guo)檢查DNA分(fen)子的完整性，來證明化(hua)合物對DNA的作用(yong)。具(ju)體步驟如下(xia)：1)堿(jian)解旋。將細胞在一定溫度的(de)暗環境(jing)中堿(jian)性(xing)處(chu)理一定時間(jian)(jian)，細胞經極短時間(jian)(jian)超聲處(chu)理后(10s)，加入(ru)濃(nong)度為0.02～0.03mol/Ｌ的堿性(xing)溶液(ye)，置于(yu)
另一種測(ce)定DNA鏈斷裂的(de)分析(xi)技術是凝膠電泳。在堿性條(tiao)件下，DNA在瓊脂(zhi)糖凝膠基質上電泳，由于遷(qian)移率(lv)的(de)不(bu)同，分子量不(bu)同的(de)DNA得(de)到(dao)分離。經過溴化乙(yi)錠染(ran)色，DNA斷裂(lie)很容易被測定出來。凝膠電(dian)泳經過合適的pH控(kong)制既可測定(ding)單鏈斷(duan)裂，也可以(yi)測定(ding)雙鏈斷(duan)裂[12，13]。
彗星測定(ding)也稱為單(dan)細胞微凝膠電泳(yong)技術(SCG)，用溴(xiu)化(hua)乙錠染色(se)能顯示DNA單鏈斷裂和(he)遇(yu)堿(jian)去堿(jian)基位點。SCG技(ji)術的(de)原理是：首先在(zai)細胞(bao)裂解液的(de)作用下破壞細胞(bao)膜、核膜和(he)其它(ta)膜結構，這(zhe)樣細胞(bao)內的(de)蛋白質、RNA及(ji)其它(ta)成分(fen)均可進(jin)入凝膠并擴散(san)到(dao)裂(lie)解液中,而核DNA因分(fen)子量(liang)高,且具有嚴(yan)密的超螺旋結構而留(liu)在(zai)原位。然后(hou)用堿處理(li)并在(zai)堿性(xing)條件(jian)下電(dian)泳(yong)，DNA解螺(luo)旋且堿(jian)變性為單(dan)鏈，若細胞DNA受損遇堿去堿基位點和單鏈斷裂,則會出現分(fen)子量較小的DNA片段。在(zai)電(dian)場(chang)中，小DNA片段就(jiu)會(hui)離開核DNA在凝膠分子篩中向(xiang)陽極移動，形似彗(hui)星(xing)，故(gu)稱為彗(hui)星(xing)實驗。DNA遷移的距離和數(shu)量就可以指示鏈(lian)斷裂的數(shu)量[14]。彗星測定法簡潔、快速、經濟(ji)，在(zai)水環境污染物質對細(xi)胞(bao)DNA損傷檢(jian)測中的應用已(yi)有很多報道。
以上(shang)是DNA鏈斷裂的幾(ji)種檢測方法。值(zhi)得(de)注意的是,在細(xi)胞內熱能(neng)正常的(de)細(xi)胞代(dai)謝過(guo)程(cheng)和(he)暴露于(yu)污染(ran)物(wu)質(zhi),都能引起DNA斷(duan)(duan)裂(lie)(lie)(lie)。因此如何區分在正(zheng)常(chang)(chang)條(tiao)件(jian)下的(de)鏈(lian)斷(duan)(duan)裂(lie)(lie)(lie)和(he)異常(chang)(chang)條(tiao)件(jian)下的(de)鏈(lian)斷(duan)(duan)裂(lie)(lie)(lie)成(cheng)為檢測關鍵。解決此問題的(de)途徑就(jiu)是(shi)選(xuan)擇一個合(he)適的(de)對照(zhao)(zhao)種(zhong)(zhong)群(qun)(qun)來作比較。理想的(de)對照(zhao)(zhao)種(zhong)(zhong)群(qun)(qun)應當沒有經受污染化合(he)物的(de)脅迫，并經歷與實驗(yan)種(zhong)(zhong)群(qun)(qun)一樣的(de)自(zi)然環境。那么，如實驗(yan)種(zhong)(zhong)群(qun)(qun)的(de)鏈(lian)斷(duan)(duan)裂(lie)(lie)(lie)數量高于對照(zhao)(zhao)種(zhong)(zhong)群(qun)(qun)，就(jiu)表明(ming)污染物質對實驗(yan)種(zhong)(zhong)群(qun)(qun)造(zao)成(cheng)了損傷。
4 問(wen)題與展望
4.1作(zuo)為污染物的生物標志物，DNA損傷的檢測提供了一種手段，用(yong)來定(ding)性和定(ding)量觀(guan)察DNA損(sun)傷形成(cheng)、由損(sun)傷帶來的DNA生物過(guo)程的改變和對靶(ba)組織損(sun)害之間的關系。但目前缺乏(fa)了(le)解DNA損傷與(yu)相關種(zhong)群(qun)、群(qun)落和生態系統水平上效應的直(zhi)接聯(lian)系，因此在(zai)這(zhe)方面需加強(qiang)研究。
4.2污(wu)染物質(zhi)對DNA所產生的(de)臨時(shi)反(fan)應(ying)可能會(hui)持續一段時(shi)間，持續時(shi)間的(de)長短(duan)依賴于(yu)有機體對損(sun)傷DNA的(de)恢復能力、毒物作用的(de)方式（慢(man)性致(zhi)毒還是急(ji)性致(zhi)毒）和毒物的(de)劑量。雖然DNA分子結構的干擾不會(hui)導致細胞(bao)的死(si)亡，但會(hui)引(yin)發其(qi)他問題，尤(you)其(qi)會(hui)干擾DNA修復(fu)的正確性。異(yi)常DNA會帶來一系列的后果，比如染色體異常、姊妹染色體交換、微核(he)形成和非整數(shu)倍、激活致(zhi)癌基因、蛋白質功能失調等[6]，這些都與有機體(ti)的表現型有關，需要(yao)建立一套新的技術與方(fang)法來檢測污染(ran)物質對有機體(ti)的影響。
4.3污染物(wu)質通常只以很(hen)(hen)低的濃(nong)度出現在環境(jing)中，一旦(dan)生物(wu)獲(huo)得(de)，就會很(hen)(hen)快(kuai)被(bei)解毒，因此污染物(wu)質只能引(yin)起(qi)DNA少量的被修飾或(huo)被損傷。此外，DNA損傷(shang)的類型也比較(jiao)多(duo)，故測(ce)定DNA的結構損傷仍存在相當大的困難。DNA損傷的檢測技術尚(shang)(shang)需進(jin)一步完善，靈敏度尚(shang)(shang)需提高(gao)，尤(you)其(qi)是(shi)對(dui)于自由基引起的DNA損傷。
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