污染物致突變性檢測（Ames試驗）
摘要： 污(wu)染物對(dui)人體的(de)(de)(de)潛在危(wei)害，引(yin)起人們的(de)(de)(de)普遍關注(zhu)。世(shi)界上已發展了百余種短(duan)期快速測試法，檢測污(wu)染物的(de)(de)(de)遺傳毒性效(xiao)應。B．N．Ames等經(jing)十余年(nian)努力(li)，于1975年建立并不斷發(fa)展(zhan)完善的沙門氏菌(jun)回復突變試(shi)驗（亦稱Ames試驗）已被世界各國廣為采用。該法比較快速、簡便、敏感、經濟，且適用于測試混合物，反映多種污染物的綜合效應。
關(guan)鍵字：污染物 突變 檢測(ce)
一、目的(de)和原理
鼠傷(shang)寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）的組氨酸營養(yang)缺(que)陷型（his－）菌株，在含微(wei)量(liang)組氨酸(suan)的(de)培養基中(zhong)，除(chu)極少數自發回復突(tu)變的(de)細胞(bao)外，一般只能(neng)分裂幾次，形成在顯(xian)微(wei)鏡下才能(neng)見到(dao)的(de)微(wei)菌落。受誘變劑作用(yong)(yong)后(hou)，大量(liang)細胞(bao)發生回復突(tu)變，自行合(he)成組氨酸(suan)，發育成肉眼可(ke)見的(de)菌落。某(mou)些(xie)化學物(wu)質需(xu)經代謝(xie)活(huo)(huo)化才有致變作用(yong)(yong)，在測試系統中(zhong)加入哺乳動物(wu)微(wei)粒體(ti)酶①，可(ke)彌(mi)補體(ti)外試驗缺乏代謝(xie)活(huo)(huo)化系統之(zhi)不足。鑒于化學物(wu)質的(de)致突(tu)變作用(yong)(yong)與致癌(ai)(ai)作用(yong)(yong)之(zhi)間密切相關，故(gu)此法(fa)現廣泛應用(yong)(yong)于致癌(ai)(ai)物(wu)的(de)篩選。
二、步驟(zou)和(he)方法
Ames試(shi)(shi)驗的(de)常(chang)規方(fang)法(fa)有斑點試(shi)(shi)驗和平板摻(chan)入試(shi)(shi)驗。
1．菌(jun)株鑒定 用于測試(shi)的(de)菌株，需經基因型和生(sheng)物學性狀(zhuang)鑒定，符合要求(qiu)才能投入使用。
目前推(tui)薦使用的一套(tao)菌(jun)株(zhu)是(shi)TA97、TA98、TA100和TA102。鑒(jian)定前先進行增菌培養(yang)。為鑒(jian)定結果可(ke)*，需同時培養(yang)野生型(xing)TV菌(jun)株，作為(wei)測試菌(jun)基因型之對照。增菌(jun)培(pei)養用牛肉膏蛋白(bai)胨液(ye)體(ti)培(pei)養基，接(jie)種(zhong)后于
鑒(jian)定項目(mu)：
（1）脂多糖屏(ping)障丟(diu)失（rfa）用(yong)接種(zhong)環或一端撓起的接種(zhong)針以無菌(jun)(jun)(jun)操(cao)作(zuo)術(shu)取(qu)各菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)的增菌(jun)(jun)(jun)培養(yang)液，在營養(yang)瓊脂平板上(shang)分別劃平行(xing)線，然后(hou)用(yong)滅菌(jun)(jun)(jun)尖頭鑷夾取(qu)滅菌(jun)(jun)(jun)濾紙條，浸濕結晶紫溶液，貼放在平板上(shang)與各接種(zhong)平行(xing)線垂直相交。蓋好皿蓋后(hou)倒置于37t溫(wen)箱，培養24h后觀(guan)察結果。
（2）R因子 劃線(xian)接(jie)種，貼放濾(lv)紙條及培養等均同上，唯濾(lv)紙條浸濕的藥液(ye)不同，為(wei)氨(an)芐青霉素(su)鈉溶液(ye)。TA102除(chu)pKM101外，還有pAQ1，載(zai)有抗四環素的基因，故另用(yong)濾紙條(tiao)浸濕四環素溶液后(hou)貼放于劃線接種的平板上。
（3）紫外線(xian)損(sun)傷修復(fu)缺陷（△uvrB）在營(ying)養瓊脂平板上(shang)按上(shang)述方法劃線接種后，一(yi)半接種線用黑玻璃(li)遮蓋，另一(yi)半暴(bao)露于紫外光(guang)下8sec，然后蓋好(hao)皿蓋并用黑(hei)紙包裹平皿，防止可見光(guang)修復(fu)作用。培養同上。
（4）自發回變 預先制備底平板；向滅(mie)菌并在水浴內保溫
（5）回變特性(xing)——診斷性(xing)試驗 上層(ceng)軟(ruan)瓊脂中(zhong)除菌液外，還(huan)注(zhu)入已知陽性物(wu)之溶液，需活(huo)化系統者(zhe)并加入S9mix，余同上。
組氨酸營養缺陷型由自發回變(bian)即可(ke)知。
菌株鑒定正確結果見(jian)表(biao)5－3和(he)圖5－1。
2．斑點(dian)試驗 吸取測試菌(jun)(jun)增(zeng)菌(jun)(jun)培養(yang)后的菌(jun)(jun)液(ye)0.1ml，注(zhu)入融(rong)化并保溫(wen)
3．平板摻(chan)入試驗 將一(yi)定量樣液和0.1ml測試菌液均加入上層軟(ruan)瓊脂中，需代(dai)謝活化(hua)的再(zai)加0.3ml－0.4ml S9mix，混勻(yun)后(hou)迅速傾于底平板上(shang)鋪平冷凝。同時做陰性和陽(yang)性對照，每種(zhong)處理做3個平(ping)行。試樣通常設4個～5個(ge)劑量(liang)。選擇劑量(liang)范(fan)圍開始應大些(xie)，有陽性或可疑(yi)陽性結果(guo)時，再在較窄的劑量(liang)范(fan)圍內確(que)定劑量(liang)反應關系。培養(yang)同上。同一劑量(liang)各(ge)皿回變(bian)菌落(luo)均數與(yu)各(ge)陰性對照皿自發回變(bian)菌落(luo)均數之比，為致變(bian)比（MR）。MR值≥2，且有劑量-反應關系，背景正常，則判為致(zhi)突變陽性（圖5-3）。
三、應用(yong)
1．斑點試驗只局限于能(neng)在瓊脂(zhi)上(shang)擴散的化(hua)學物(wu)質(zhi)，大多數多環芳烴(jing)和難溶于水的化(hua)學物(wu)質(zhi)均不(bu)適宜用(yong)此法(fa)。此法(fa)敏(min)感性較(jiao)差，主要是一(yi)種(zhong)定(ding)性試驗，適用(yong)于快(kuai)速(su)篩選大量受試化(hua)合(he)物(wu)。
2．平板摻入試驗可定量測試樣(yang)品致(zhi)突變(bian)性的(de)強弱(ruo)。此法較(jiao)斑點試驗敏感，獲陽性結果所需的(de)劑量較(jiao)低。點試獲陽性結果的(de)濃度用于摻入試驗（每皿0.1ml），往往出現(xian)抑（殺）菌作用。
3．致變作(zuo)用遲緩或有抑菌作(zuo)用的試樣，培養時間(jian)延長(chang)至72h。
4．揮(hui)發性(xing)的(de)液體(ti)和(he)氣體(ti)試樣，可(ke)用干燥器內(nei)試驗(yan)法進行測試。
5．目前，Ames試(shi)(shi)驗作為檢(jian)測環(huan)境誘變劑的(de)一組試(shi)(shi)驗中的(de)首選試(shi)(shi)驗，廣泛應用于致突變化學物(wu)的(de)初篩。但是，與今天快信息、高效率的(de)社會要求(qiu)相比，該(gai)試(shi)(shi)驗程(cheng)序還嫌繁瑣，方法(fa)不夠簡(jian)便，有(you)待(dai)于創建新的(de)更為快速靈敏、簡(jian)單易行(xing)的(de)環(huan)境誘變劑短(duan)期(qi)生物(wu)測試(shi)(shi)法(fa)。
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