有害藻華（HABs）監測/預警的新解決方案
內容提供：澤泉生態開放實驗室
1 背景
伴隨著我國經濟快速發展的同時，生態環境持續惡化。近年來我國水體中有害藻華（Harmful Algal Blooms，HABs）（包括海洋赤潮和淡水水華）持續高頻次發生，已嚴重影響到居民的飲水安全、水產養殖、水體景觀價值等方面，造成了巨大的經濟損失。我國各級政府部門和科研機構對水體中浮游植物群落的動態變化進行快速監測、對淡水藍藻水華和海洋硅藻/甲藻赤潮進行早期預警的需求越來越強烈。
目前我國浮游植物和有害藻華的監測主要采用顯微計數、葉綠素含量測定、衛星遙感等技術。顯微計數采集的樣品需要經過魯格氏液、甲醛等固定液固定，帶回實驗室沉淀濃縮后進行定性定量分析，需要花費的時間較長。此外，顯微鏡下藻類分類和計數需要非常專業的人員，且分析樣品的效率較低（一般而言，對一個樣品同時進行定性定量分析約需2 h）。葉綠素含量測定是一種相對較快速簡單的測量技術，但傳統的測量方法多為現場抽濾后帶回實驗室抽提，然后進行分光光度計分析、熒光分光光度計分析或高效液相色普（HPLC）分析，但這種技術最快也需要1－2天才能獲得結果。這兩種方法均不能立即反映出水體中的藻類信息，而是要經過一段分析時間，從而降低了生物監測的時效性，大大影響有害藻華的監測/預警。此外，葉綠素含量測定也可用原位傳感器進行連續監測，但這種方法多采用若丹明法（化學法）校正數據，誤差大，且傳感器需要經常維護。衛星遙感具備監測范圍廣、數據多、不受地理位置和人為條件限制等優點，但其容易受天氣條件影響，且往往需要藻類細胞累積到一定程度（可能已經發生藻華）才能監測到，往往達不到預警的效果，而且購買衛星遙感數據費用高，分析復雜，因此衛星遙感多在專業機構進行。
為配合國內相關科研和監測單位進行有害藻華的快速現場監測并進行早期預警，澤泉生態開放實驗室推出“有害藻華（HABs）監測/預警的新解決方案”。
2 有害藻華（HABs）監測/預警的新解決方案
2.1 監測功能：
1） 利用浮游植物熒光儀PHYTO-PAM現場測量藍藻、綠藻、硅/甲藻的葉綠素a含量和總葉綠素a含量，以及它們的光合活性（“生長潛能”）
2） 利用便攜式浮游植物流式細胞儀CytoSense或水下浮游植物流式細胞儀CytoSub對浮游植物細胞數進行快速計數，并獲知主要類群的細胞濃度、細胞大小、細胞形態學信息；獲知微囊藻、棕囊藻等的群體（囊）動力學變化情況；對于鏈狀藻類，可以測量每條鏈的細胞數；對于硅藻、甲藻等形狀特殊的藻類，可根據浮游植物專家庫鑒定到種
3） 利用在線監測型浮游植物流式細胞儀CytoBuoy對水體中的浮游植物進行長期連續監測
2.2 預警功能：
1） 根據葉綠素a含量和細胞數變化趨勢進行預警
2） 浮游植物的光合活性（“生長潛能”）預示著未來的生長潛力，光合活性高、耐強光的浮游植物在環境條件（營養鹽、光照、溫度）適合時更容易發生藻華，
3） 微囊藻、棕囊藻等帶囊的藻類，不形成囊不發生藻華，而利用CytoSense等可長期監測水體中微囊藻、棕囊藻等“囊”的變化，進行早期預警
2.3 所需設備及用途：
1） 浮游植物熒光儀PHYTO-PAM
* 現場快速對水樣中的藍藻、綠藻、硅/甲藻自動定性（分類）定量（測葉綠素a）
* 現場快速測量藍藻、綠藻、硅/甲藻的光合活性（“生長潛能”）
2） CytoBuoy系列浮游植物流式細胞儀（CytoSense、CytoBuoy、CytoSub）
* 現場快速計數水體中浮游植物細胞總數
* 現場快速獲取浮游植物細胞類群信息（濃度、大小、類群、定種）
* 現場快速測量微囊藻、棕囊藻等細胞數以及“囊”的比例
3 浮游植物熒光儀技術原理及儀器介紹
3.1 利用葉綠素熒光測量葉綠素a含量的原理
浮游植物細胞中的葉綠素分子吸收的光能，一部分用于進行光合作用，一部分以熱的形式耗散到環境中，剩余的部分以熒光的形式發射出來。活體葉綠素熒光的強度與細胞吸收的光強有關，但在很弱的光強下，葉綠素熒光強度只與葉綠素含量的高低有關。因此可通過測量特定光強下（儀器控制）浮游植物細胞發出的葉綠素熒光強度來測量葉綠素a含量。
3.2 利用PHYTO-PAM對浮游植物分類的原理
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藍藻、綠藻、硅藻/甲藻往往是水體中的優勢種。藍藻的主要捕光色素是藻膽蛋白，偏好吸收橙紅色光（645 nm）；綠藻的主要捕光色素是葉綠素a和b，偏好吸收藍光（470 nm）和紅光（665 nm）；硅藻和甲藻的色素相同，都是類胡蘿卜素和葉綠素c，偏好吸收綠光（520 nm）。PHYTO-PAM利用藍色（470 nm）、綠色（520 nm）、淺紅色（645 nm）和深紅色（665 nm）的發光二極管（LED）給出微秒級的測量光脈沖。不同顏色的測量光脈沖在高頻率下交替應用，就可以獲得4種波長的光激發出的半同步的熒光信號。結合純種藻類的參考光譜（Reference spectrum）就可對藍藻、綠藻、硅/甲藻進行分類（定性），進而分別測量它們的葉綠素a含量和光合活性。由于硅藻和甲藻的色素組成差別不大，目前技術上還很難對它們進行區分。
3.3 利用PHYTO-PAM測量光合作用的原理
如 3.1所述，（活體細胞中）葉綠素吸收的光分三條通路：光合作用（P）、熱耗散（D）和熒光（F）。根據能量守恒，P＋D＋F＝1。PHYTO-PAM可以直接檢測熒光強度，還可提供一個超強飽和閃光（1 s內）使光合作用暫時被抑制，由此可知熱耗散的量，進一步可知光合作用活性。這項技術已成為目前最方便、快捷的檢測植物光合作用的方法，其發明人 Schreiber教授因此獲得首屆國際光合作用協會創新大獎。
PHYTO-PAM可以測量的光合作用參數包括：
* Fv/Fm，浮游植物的潛在最大光合效率（“生長潛能”）
* Y，給定光強下浮游植物的實際光合效率
* ETR，給定光強下浮游植物的實際光合速率
* ETRmax，浮游植物的潛在最大光合速率
* a，浮游植物對光強的利用能力
* Ik，浮游植物耐受強光的能力
* 快速光曲線，結合水體光場可用于計算水體初級生產力
3.4 利用浮游植物光合活性進行水華預警的原理
藻類的生長靠光合作用，藻華的爆發是在特定的環境條件下（富營養、高光、高溫）由藻類短期快速暴增造成的，這其間藻類必須具備極強的光合作用才能快速生長。監測葉綠素a含量可以了解目前水體中的藻類生物量，但這只代表歷史（如果營養鹽很低，即使當前藻類生物量高，也不具備發生藻華的可能）；而監測藻類的光合作用活性可以了解藻類的“生長潛能”，結合其它環境條件可以預測未來（富營養條件且高光高溫下，即使當前藻類生物量不高，但只要光合作用活性強，就具有極大的發生藻華的可能）。由于PHYTO-PAM可以測量自然水樣中藍藻、綠藻和硅/甲藻各自的光合作用，就可以對藻華發生時不同藻類類群進行分析。利用PHYTO-PAM測量不同藻類葉綠素a含量和光合作用活性的功能，可以長期監測自然水體中浮游植物種群生物量的動力學變化和不同類群光合作用潛力的變化趨勢，這對于藻華的預警具有重要參考價值。
3.5 浮游植物熒光儀PHYTO-PAM的主要功能
?* 全世界第一臺可對浮游植物自動分類的調制葉綠素熒光儀
?* 可對藍藻、綠藻和硅/甲藻自動分類（定性）
?* 可自動測量水樣中藍藻、綠藻和硅/甲藻的葉綠素a含量和總葉綠素a含量（定量）
?* 可同時測量水樣中藍藻、綠藻和硅/甲藻的光合作用活性
?* 可測量光合作用的光合效率和電子傳遞速率
?* 可自動記錄光合效率和電子傳遞速率的快速光響應曲線
?* 用戶可做自己的參考光譜
?* 專業PhytoWin操作軟件，數據收集、分析和存貯功能強大
?* 用戶可利用培養的微藻做參考光譜，非“黑匣子”
?* 可在野外測量后根據水體藻類組成利用優勢種（一種或多種）的參考光譜校對實驗結果
4 浮游植物流式細胞儀技術原理及儀器介紹
4.1 利用流式細胞儀進行浮游植物細胞計數的原理
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流式細胞儀的基本原理：根據流體動力學原理讓液體中的顆粒（包括細胞）逐一通過激光束（檢測區），激光照射到顆粒上會引起光的散射，如果顆粒（如藻細胞）含有色素還可以發出熒光，這些散射光和熒光被檢測器收集后轉換成電信號存儲下來，并利用軟件進行自動分析。水中的浮游植物細胞做為一個個顆粒，當然可以進行流式細胞計數。
一臺功能強大的流式細胞儀可以檢測浮游植物細胞的前向光散射（FWC）、側向光散射（SWC）和多色熒光。這些信號除了用于進行細胞計數外，還包含如下信息：前向光散射反映了細胞的大小；側向光散射反映了細胞的形狀；多色熒光則反映了細胞含有哪些色素。這些信息結合起來可以對不同類型的細胞進行聚類（聚群）分析。
4.2 傳統流式細胞儀進行浮游植物細胞計數的缺陷
傳統的商用流式細胞儀都是為生物醫學研究設計的，用于免疫學、分子生物學、細胞生物學等領域，盡管也有人用于浮游植物研究，但由于以下缺點難以進行有害藻華監測和預警：
* 儀器沉重、無法在野外使用
* 每次測量需要復雜的校準，每次開機需要校準，儀器移動后需要校準
* 必須專人管理，使用人員必須經過長期培訓
* 測量粒徑范圍小，一般為0.4微米至幾十個微米，多數浮游植物細胞超過了其監測范圍
* 測量濃度范圍小，一般為105－106個細胞/升，樣品過濃需要稀釋，樣品過稀需要濃縮
* 樣品必須經過嚴格的預處理（過濾、分級等）才可測量
* 無法直接測量微囊藻、棕囊藻等群體樣品，需要預先打碎群體
* 需要外加鞘液，用量大
* 維護成本高
4.3 浮游植物流式細胞儀的主要特性
CytoBuoy系列浮游植物流式細胞儀是專為浮游植物研究設計的流式細胞儀，適用于野外現場測量，充分考慮到了藻類樣品的復雜性和儀器的便攜性、抗震性。
* 全球唯一專為浮游植物研究設計的流式細胞儀
* 儀器便攜、防震、防抖、耐沖擊、防水或防濺水
* 操作簡單，不需復雜的校準，不需專人管理
* 測量粒徑范圍大，覆蓋幾乎所有的浮游植物粒徑范圍：1－4000 mm（標準版）或0.4－4000 mm（pico-版）
* 測量濃度范圍大，達102－1010個細胞/升
* 樣品不需預處理即可直接測量
* 利用GV模塊可直接測量帶氣囊的藻（微囊藻、棕囊藻）
* 不需外加鞘液，利用樣品過濾液做為循環鞘液
* 可獲取每個細胞所有檢測信號的掃描圖譜，每個圖譜可獲得9個拓撲學指標，內含豐富的形態學信息
* 可建立浮游植物專家庫，對硅藻、甲藻等形態特殊的種類鑒定到種
* 可升級增加成像功能，拍攝特定細胞的照片
4.4 浮游植物流式細胞儀的應用模式
CytoBuoy系列浮游植物流式細胞儀有三種型號：
* 便攜式浮游植物流式細胞儀CytoSense
* 在線監測型浮游植物流式細胞儀CytoBuoy
* 水下浮游植物流式細胞儀CytoSub
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CytoSense屬于便攜式儀器，可在室內、野外、船上（包括小艇）使用。
CytoBuoy用于定點長期監測，數據可遠程無線傳輸。
CytoSub可用于水下剖面測量或AUV搭載巡航測量，可自容式測量，可在線測量。
根據需要，CytoSense可升級為CytoBuoy或CytoSub。
4.5 浮游植物流式細胞儀測量微囊藻的方法
有些浮游植物（如微囊藻）帶有氣囊。氣囊會改變光散射，從而會改變這類浮游植物的“光學指紋”。通過GV模塊施加瞬間高壓可以打破氣囊，從而消除由于氣囊引起的光散射變化，修復“光學指紋”。通過兩次測量可以方便的區分出帶氣囊的種：第一次直接測量，第二次施加高壓破壞氣囊后測量。那些在施加高壓后改變了光散射的種就是帶氣囊的種。
微囊藻、棕囊藻等帶囊的藻類，不形成囊不發生藻華，而利用CytoSense等可長期監測水體中微囊藻、棕囊藻等“囊”的變化，進行早期預警。
4.6 浮游植物流式細胞儀鑒定到種的方法
當細胞顆粒在流動池中通過檢測區域時，CytoBuoy系列流式細胞儀可以掃描記錄各種光學信號（散射、熒光）的動態變化（掃描圖譜，全球唯一），這些信號包涵了豐富的細胞形態學信息，利用這些形態學信息可以建立浮游植物特征信息專家數據庫，進而利用CytoBuoy進行浮游植物的詳細分類，有助于了解浮游植物的種群變化和水華預警。
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每個細胞的掃描圖譜包含了豐富的形態學信息
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這些形態學信息可用于建立浮游植物專家庫
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軟件根據掃描圖譜，可以獲知鏈狀細胞的具體細胞數目
4.7 浮游植物流式細胞儀應用于高濁度水體的對策
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1）進樣篩選
水樣被進樣器采集后，在進樣器內部經過篩選排除空氣和砂粒。進樣器內部設計獨特，從上到下有三個出水口，其中上邊的出水口用于排除空氣，而多數砂粒由于沉降速率較大會經下部出水口排除，只有中間的出水口用于采集浮游植物、浮游動物和與它們密度相差不大的砂粒進行流式細胞計數和其它分析。如果水中砂粒粒徑很大，可以在進樣器中增加一個不銹鋼篩網，用于濾除粒徑大于1 mm的泥沙顆粒。對于多數粒徑大于50-100 mm的砂粒而言，它們的沉降速率大于CytoSense的進樣流速（1-2 cm/s），因此不會被進樣器吸入。
2）外置鞘液系統
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5 有害藻華監測/預警展望
綜上所述，浮游植物熒光儀PHYTO-PAM和CytoBuoy系列浮游植物流式細胞儀在有害藻華的監測/預警方面具有非常大的應用潛力，前者重在自動分類的基礎上同時了解生物量和光合活性（“生長潛能”），后者重在專門針對浮游植物的細胞計數，且可直接測量微囊藻，對形狀特殊的藻可鑒定到種。兩種技術都是目前國際上最前沿的技術，且儀器都是為野外應用而設計，充分考慮到了現場監測的困難。兩種技術可分別用于有害藻華的監測/預警，如果結合使用，對于監測/預警的效果會更好。相信兩種技術對于我們淡水與海洋環境的有害藻華監測/預警都會發揮極大的助力作用。
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