混合菌修復石油污染土壤的最佳方案
更新時間：2014-07-12 18:24
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石油及其制品在生產、加工、運輸和使用過程中產生的大量石油污染物進入環境，對土壤造成了嚴重污染，因此對石油污染土壤的治理已迫在眉睫。石油污染土壤治理技術中，與物理修復、化學修復技術相比，微生物修復技術因其修復效果好、操作簡便、費用低、降解過程迅速和無二次污染等特點，被廣泛采用。微生物修復技術的本質是通過微生物的代謝活動將污染物降解，修復過程所用的微生物多為土著微生物；若要提高修復效果，還需引入馴化的高效石油降解菌。
相比于正交設計，均勻設計的主要優勢是：在因素和水平數均較多的情況下，用較少的實驗次數就可獲得期望的結果，節省人力和物力，便于實施。目前，國內還少見將均勻設計法用于石油污染土壤微生物修復技術的研究報道。本工作采用從東營石油污染土壤中富集、分離出的4種高效石油降解菌，對模擬石油污染土壤進行微生物修復。在單菌種使用效果不理想的情況下，研究了多種高效石油降解菌混合使用的效果，確定了各菌的最佳配比及菌群的最優培養條件，并進一步從理化性質、酶活性和微生物種群數量方面比較了土壤經微生物修復前后的變化，為東營石油污染土壤微生物修復的現場應用提供了技術參考和理論支持。
1、實驗部分
1.1 材料、試劑和儀器
原油：山東省東營市某煉油廠；土壤：山東省東營市東營未受污染的淺層（5~25cm）土壤。土壤經破碎、除雜、混勻、篩分后，按原油與土壤質量比為1∶20混合均勻，制成模擬石油污染土壤（模擬土樣），并將其密封儲存在滅菌牛皮紙袋內冷藏備用。
LB培養基：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，瓊脂15g/L；菌種（包括根瘤菌（A）、節細菌（B）、嗜鹽菌（C）和芽孢桿菌（D））：實驗室保藏；表面活性劑：主要成分為槐糖脂。
PHS-3型酸度計：上海精密科學儀器有限公司；
721型可見光分光光度計：北京光學儀器廠。
1.2 實驗方法
1.2.1 4種單菌與土著微生物石油降解率的比較
采用LB培養基保藏4種單菌。將模擬土樣按每份50g分別裝入80個錐形瓶中，并將錐形瓶分成5組，每組16個。取其中4組分別以50.0mL/kg的接種量加入A，B，C，D菌懸液，置于28℃恒溫箱中。剩余1組未加菌種，作為對照樣考察土著微生物的修復作用。每間隔一段時間取樣，采用重量法測定土壤試樣中石油的含量，計算石油降解率。
1.2.2 優勢菌群的構建和最佳配比的確定
對4種菌進行2種、3種、4種的組合，分別將不同組合的混合菌按一定的接種量加入到模擬土樣中，每組加入的混合菌菌懸液的總接種量均為50.0mL/kg，各加入菌的接種量分別相等。在28℃的恒溫箱中放置40d后，測定土壤試樣中石油的含量，計算石油降解率，從而構建出優勢菌群。采用均勻設計法對優勢菌群的配比進行優化。
1.2.3 培養條件優化實驗選取
5個影響石油降解率的代表性因素：混合菌接種量、土壤含水率、雞糞加入量、麥糠加入量和表面活性劑加入量，并將其控制在不同水平，采取均勻設計考察各因素對修復效果的影響。按確定的最佳配比將4種菌接種到石油污染土壤中，在28℃的恒溫箱中放置40d后，測定土壤試樣中石油的含量，計算石油降解率。
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